糖是一类具有重要生物学功能的大分子，具有高度复杂的化学结构。糖的结构解析目前仍依赖于传统的色谱法、质谱法和核磁法等结构表征手段。虽然这些方法相对成熟，但存在检测步骤复杂、无法实时动态检测等局限性，无法满足快速增长的糖基础和应用科研需求。特别是与另一类生物大分子核酸已实现高通量测序相比，糖的结构解析技术严重滞后。生物纳米孔作为高度敏感的传感器，已成功应用于核酸分子以及多肽测序，但在糖测序方向是否可行尚未获得证实。
近期，中国科学院上海药物研究所高召兵/夏冰清（纳米孔方向），文留青（糖化学方向），程曦（计算生物学方向）等组成联合交叉攻关团队，设计并构建了一种工程改造的生物纳米孔，识别和捕捉到糖分子官能团乙酰氨基和羧基的特征电信号，描绘了含有这两种官能团不同聚合度糖的电信号指纹图谱，并成功运用于混合体系中不同糖分子的结构鉴定。该工作为生物纳米孔为基础的糖测序技术打开一扇门。相关研究工作于2023年8月1日以“mapping the acetylamino and carboxyl groups on glycans by engineered α-hemolysin nanopores”为题在线发表在 journal of the american chemical society上，并被选为封面文章。
首先，研究团队将纳米孔α-溶血素（α-hl）的敏感位点113位的甲硫氨酸（m）进行了基因工程改造，通过对极性、体积、电荷等氨基酸筛选，获得敏感性、特异性最佳的工程纳米孔m113r。利用该纳米孔清晰地表征了单糖分子中乙酰氨基和羧基两种糖官能团的电流信号，并建立了其结构与电信号对应的指纹图谱。随后，研究团队利用分子动力学模拟和基因突变对糖分子进入该纳米孔中的动态过程进行进一步剖析，明确了纳米孔m113r识别两种官能团的分子机制；基于此，研究团队利用两种官能团的特征电信号进一步绘制了含有乙酰氨基和羧基寡糖的指纹图谱。最后，团队成员利用指纹图谱在糖混合体系中成功识别了含有两种基团的单糖、二糖和三糖。该项技术采用工程改造的纳米孔，无需对糖进行额外化学修饰或桥接。这一概念验证研究为高效建立糖分子指纹图谱库提供重要基础。
糖类化学信息的高效表征仍然是糖结构解析中的一个关键挑战。与其它根据化学位移或峰强度信息的技术不同，该研究依据特征电信号分析糖分子结构信息，获得糖分子中特定官能团的特征信号，将分子结构信息与传感事件产生的特征电信号直接联系。特征电信号不仅能表征单糖分子的特殊结构，还能同时精确解读寡糖链的聚合度的大小，能从多个维度反映糖分子结构的多方面特征。本研究获得的糖电信号指纹图谱是基于纳米孔糖结构鉴定分析的重要一步，并正式提出基于纳米孔糖测序的可能路线。随着对糖分子更多官能团和其它特定结构的鉴定，逐步完善糖分子指纹图谱的全方位绘制，建立基于电信号的糖指纹图谱库，有望最终实现不同于现有技术路线的高效糖结构表征—纳米孔糖测序。
上海药物所副研究员夏冰清，上海药物所/南京中医药大学联合培养博士生方洁，上海药物所博士后马圣洲和研究生马梦瑶为本文第一作者；上海科技大学联合培养博士生姚广大，上海药物所研究员李铁海为本文共同作者；上海药物所高召兵研究员、文留青研究员、程曦研究员和夏冰清副研究员为共同通讯作者。本研究工作得到了上海药物所蒋华良研究员、南京大学龙亿涛教授和应佚伦教授的支持和帮助。本研究获国家杰出青年基金、青促会创新基金、上海市糖专项、上海市科技创新行动计划基金、上海市启明星计划、上海市自然科学基金、国家重点实验室计划、国家重点研发计划和中国科学院战略性科技先导项目的支持。
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图1. jacs 封面（利用工程改造的纳米孔绘制糖电信号指纹图谱）
图2. 电信号指纹图谱识别混合体系中单糖、二糖和三糖
